· поліакриламідГель повинен бути отриманий шляхом утворення мономеру акриламіду, вихідного матеріалу для полімеризації, каталізатора та суміші солі та буфера.
· акриламіда BIS (N, N'-метиленовий подвійний акриламід) є мономером у формі гелевої матриці.
· персульфат амонію запускає процес полімеризації клею. Для приготування клею потрібен 10% розчин персульфату амонію, приготований у воді. Більшість інформації вказувала на необхідність активного використання. Однак 10% розчин можна зберігати при температурі 4℃ протягом кількох тижнів без значної втрати активності. Доведіть до 10 мл та викиньте, коли клей перестане агрегуватися.
Порада: ВідсотокакриламідУ секвенуванні клей та білковий клей – це не одне й те саме. Якщо ви використовуєте готовий розчин акриламіду:BIS, переконайтеся, що ви отримали правильну пляшку.
· ТЕМЕД (N, N, N ', N '- тетраметилетилендіамін) – каталізатор, у коричневій пляшці, поміщеній у холодильник. Додати безпосередньо перед заливкою клею.
· поліакриламідний електрофорез. Використане в електрофорезі скло слід мити до та після кожного разу. Після електрофорезу помийте м’якою щіткою та тканиною в гарячій мильній воді, промийте дистильованою водою та дайте висохнути.
· волога та пил можуть спричинити пошкодження порожнистого полімеру. Перед електрофорезом очистіть скляну пластину засобом для чищення скла та протріть її м’якою щіткою. Вимийте дистильованою водою та ретельно висушіть паперовою серветкою. Промивання 70% етанолом перед протиранням папером допомагає очистити та пришвидшити висихання. Послідовно додайте зразки акриламіду: BIS, воду, буферний розчин, персульфат амонію, TEMED. Добре струсіть та одразу вилийте.
Немає потреби дегазувати поліакриламід перед полімеризацією. (Раніше акриламід поміщали у вакуум для видалення бульбашок, оскільки кисень гальмує полімеризацію.)
Зразки горизонтальних клейових точок.
· Покладіть аркуш чорного паперу в нижню коробку, чорний фон, щоб зробити отвір для зразка, щоб його було краще видно.
· буфер, заповнений резервуаром для клею, безпосередньо поверх колоїду.
· якщо на краю є світло, увімкніть світло, нехай світло світить колоїдно. Наберіть зразок у піпетку.
· за допомогою автоматичного піпетувального пристрою.
· у зразку розміром 10-200 мкм можна використовувати 1 рухому точку рідини в більшості точок. Для дуже малих отворів зразка (менше 10 мкм) зручніше використовувати довгу піпетку для секвенування клею.
· піпетування, щойно занурене у зразок, вдихаючи повільно рухому рідину. Зразок може виглядати липким від гліцерину, а швидке накачування може втягнути бульбашки повітря в головку піпетки.
· Після вдихання зразків піпетуючою головкою обережно переміщуйте рідинну головку по краю трубки або витираючи папір, щоб відсмоктати рідинну головку за межі крапель. Будьте обережні, щоб не відсмоктати зразок.
Помістіть зразок у отвір для зразка
· піпетувальний пристрій для підтримки невеликого тиску, змушуйте зразки трохи рухати переливну рідинну головку зразків.
· Піпетуюча головка, вставлена в буфер, трохи вище за точкові отвори, підтримує позитивний тиск. Кінчик піпетки можна вставити в невеликий отвір.
· повільно та стабільно виймайте зразки. Кінчик піпетки розміщують над отвором для зразка, і зразок занурюється в отвір. Дайте зразку зануритися, щоб заповнити отвір, замість того, щоб проштовхувати його всередину.
· як тільки остання крапля зразка збереться з рідинною головкою, рідина переміститься до другої ніжки, повільно піднімаючи рух рідини, вийде з буфера
Як зробити вертикальний відбір проб клею?
· вертикальні отвори для зразка, що утворюються між двома шматками скла. У дуже рідкому клеї головку піпетки навіть не можна вставити між двома скляними пластинами. Слідкуйте за гліцерином! Помістіть головку піпетки над отвором для зразка, і зразок зануриться в отвір.
· Перед відбором зразка обов'язково промийте отвір для зразка вертикальною точкою з поліпропіленового ацильного гелю та ретельно змийте його. Змийте неполімеризований акриламід та воду, яка може з'явитися на дні отвору для зразка. Вода може значно зменшити отвір для зразка. Використовуйте шприц об'ємом 25 мл або 50 мл та голку 18-го калібру. Влийте буфер для електрофорезу та ретельно промийте отвір для зразка.
· Може бути важко побачити отвір для зразка, але водночас все інше легко зробити. Якщо є зайві отвори, буфер для зразка можна перевірити бромфеноловим синім.
Час публікації: 31 березня 2023 р.